名稱：人正常胰腺類器官培養基試劑盒

貨號：WS002-100-KIT/WS002-500-KIT

規格：100ml/500ml

品牌：WinSera

人正常胰腺類器官培養基是一款促進人正常胰腺類器官體外形成和擴增的培養基。該產品為無菌的液體混合系統，含有維持目的細胞生長所必需的氨基酸、維生素、有機和無機化合物以及生長因子等。該培養基的du特配方可以提供一個合適的細胞所需營養環境，促進人正常胰腺類器官的體外生長和擴增。
一、試劑盒組成：

、1、原代
（1）將組織放入含有特殊組織保存液E的組織取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離，拍照并登記信息。
（2）準備若干培養皿，加入 4℃預冷的人正常胰腺類器官培養緩沖液B備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養皿中，利用人正常胰腺類器官培養緩沖液B清洗三次后，利用眼科jian或手術dao將腫瘤組織jian切成體積約為 1-3 mm3的組織塊。
（4）組織用人正常胰腺原代組織xiao化液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70 um 以下的細胞簇后，加入三倍體積人正常胰腺類器官培養緩沖液B終止消化。
（6）使用100 um孔徑的篩網進行過濾，將濾液收集后，于300 g富集離心5 min后移去上清，添加人正常胰腺類器官培養緩沖液B重新重懸離心。
（7）基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠（abs9495）重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養板為例，每孔點膠25 ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15 min成膠，添加人正常胰腺類器官培養基A（恢復室溫）進行培養。

2、類器官傳代培養
（1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2 ml 4℃類器官緩沖液B放置2 min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15 ml離心管中，4℃靜置10 min。（每6-8孔為一組）
（3）A：類器官數量不足或體積較小時： 離心5 min棄去上清，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入1.5 ml離心管，300 g離心5 min棄去液體進行第4步。
         B：類器官數量較多或體積較大時：離心5 min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液D消化2-3 min，添加人正常胰腺類器官緩沖液B終止消化，離心5 min棄去混合液，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入1.5 ml離心管，300 g離心5 min棄去液體進行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25 ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15 min添加500 ul人正常胰腺類器官培養基A。

3、類器官凍存
（1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2 ml 4℃類器官緩沖液B放置2 min。
（2）移液搶輕柔吹打基質膠，收集在15 ml離心管中，4℃靜置10 min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5 min棄去上清，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B再次重懸，300 g離心5 min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積4 ml。
（5）做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存。

4、類器官復蘇
（1）取10 ml人正常胰腺類器官培養緩沖液B于15 ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 min內wan全融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15 ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300 g離心5 min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入5 ml離心管300 g離心5 min。
（5）基質膠重懸，每孔25 ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15 min成膠，添加500 ul人正常胰腺類器官培養基A。
（1）將組織放入含有特殊組織保存液E的組織取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離，拍照并登記信息。
（2）準備若干培養皿，加入 4℃預冷的人正常胰腺類器官培養緩沖液B備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養皿中，利用人正常胰腺類器官培養緩沖液B清洗三次后，利用眼科jian或手術dao將腫瘤組織jian切成體積約為 1-3 mm3的組織塊。
（4）組織用人正常胰腺原代組織xiao化液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70 um 以下的細胞簇后，加入三倍體積人正常胰腺類器官培養緩沖液B終止消化。
（6）使用100 um孔徑的篩網進行過濾，將濾液收集后，于300 g富集離心5 min后移去上清，添加人正常胰腺類器官培養緩沖液B重新重懸離心。
（7）基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠（abs9495）重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養板為例，每孔點膠25 ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15 min成膠，添加人正常胰腺類器官培養基A（恢復室溫）進行培養。

2、類器官傳代培養
（1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2 ml 4℃類器官緩沖液B放置2 min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15 ml離心管中，4℃靜置10 min。（每6-8孔為一組）
（3）A：類器官數量不足或體積較小時： 離心5 min棄去上清，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入1.5 ml離心管，300 g離心5 min棄去液體進行第4步。
         B：類器官數量較多或體積較大時：離心5 min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液D消化2-3 min，添加人正常胰腺類器官緩沖液B終止消化，離心5 min棄去混合液，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入1.5 ml離心管，300 g離心5 min棄去液體進行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25 ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15 min添加500 ul人正常胰腺類器官培養基A。

3、類器官凍存
（1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2 ml 4℃類器官緩沖液B放置2 min。
（2）移液搶輕柔吹打基質膠，收集在15 ml離心管中，4℃靜置10 min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5 min棄去上清，添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B再次重懸，300 g離心5 min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積4 ml。
（5）做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存。

4、類器官復蘇
（1）取10 ml人正常胰腺類器官培養緩沖液B于15 ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 min內全部融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15 ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300 g離心5 min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量人正常胰腺類器官緩沖液B重懸移入5 ml離心管300 g離心5 min。
（5）基質膠重懸，每孔25 ul基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15 min成膠，添加500 ul人正常胰腺類器官培養基A。

三、儲存/保存方法

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溫馨提示：本產品僅作科研實驗使用，不支持臨床等研究

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